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數字PCR技術的發展和原理
點擊次數:3304 發布日期:2018-7-24  來源:本站 僅供參考,謝絕轉載,否則責任自負

數字PCR即Digital PCR(dPCR),它是一種核酸分子絕對定量技術。相較于qPCR,數字PCR可讓你能夠直接數出DNA分子的個數,是對起始樣品的絕對定量。

定量PCR時,我們常常糾結一個問題,究竟是相對定量還是絕對定量呢?如今,你無需糾結了,因為數字PCR(digital PCR)來了。盡管這兩種技術有些類似,都是估計起始樣品中的核酸量,但它們有一個重要的區別。定量PCR是依靠標準曲線或參照基因來測定核酸量,而數字PCR則讓你能夠直接數出DNA分子的個數,是對起始樣品的絕對定量。因此特別適用于依靠Ct值不能很好分辨的應用領域:拷貝數變異、突變檢測、基因相對表達研究(如等位基因不平衡表達)、二代測序結果驗證、miRNA表達分析、單細胞基因表達分析等。

技術發展:

20世紀末,Vogelstein 等提出數字PCR( digitalPCR,dPCR) 的概念,通過將一個樣本分成幾十到幾萬份,分配到不同的反應單元,每個單元至多包含一個拷貝的目標分子( DNA 模板) ,在每個反應單元中分別對目標分子進行PCR 擴增,擴增結束后對各個反應單元的熒光信號進行統計學分析。

數字PCR技術不斷發展,Bio-Rad、LIFE Technologies及RainDance等廠家相繼推出技術較為成熟的數字PCR產品。

QuantaLife公司開發出的微滴數字PCR技術。該產品還獲得了2011年度Frost & Sullivan北美新產品創新獎。2011年10月,Bio-Rad公司收購了QuantaLife和ddPCR技術,相繼推出了QX100、QX200微滴式數字PCR系統。

與其他數字PCR技術不同,Bio-Rad對樣品進行微滴化處理。據該公司基因表達部門的銷售經理Richard Kurtz介紹,他們的獨特優勢是能夠產生非常均一、重復的1納升液滴。這樣的好處是每個樣品形成20,000個液滴,而其他系統只能分成760-3,000個部分。分得越多,則意味著分析越準確。

數字PCR是一種核酸分子絕對定量技術。當前核酸分子的定量有三種方法,光度法基于核酸分子的吸光度來定量;實時熒光定量PCR(Real Time PCR)基于Ct值,Ct值就是指可以檢測到熒光值對應的循環數;數字PCR是最新的定量技術,基于單分子PCR方法來進行計數的核酸定量,是一種絕對定量的方法。主要采用當前分析化學熱門研究領域的微流控或微滴化方法,將大量稀釋后的核酸溶液分散至芯片的微反應器或微滴中,每個反應器的核酸模板數少于或者等于1個。這樣經過PCR循環之后,有一個核酸分子模板的反應器就會給出熒光信號,沒有模板的反應器就沒有熒光信號。根據相對比例和反應器的體積,就可以推算出原始溶液的核酸濃度。

原理:

PCR實際上是一個在模板DNA、引物(模板片段兩端的已知序列)和四種脫氧核苷酸等存在的情況下,DNA聚合酶依賴的酶促合成反應,擴增的特異性取決于引物與模板DNA的特異結合。

數字PCR(Digital PCR)儀器

伯樂生命bio-rad QX200 微滴式數字PCR (ddPCR) 系統可對DNA或RNA分子進行絕對定量分析,適用于 EvaGreen 或基于探針的數字PCR應用領域。

QX200 Droplet數字PCR(Digital PCR) 系統的應用領域:

癌癥生物標志物研究和拷貝數變異分析
以卓越的靈敏度和準確度測量癌癥突變的變異程度、檢測稀有的 DNA 靶拷貝以及解析拷貝數變異狀態。
病原體檢測
精確地對靶 DNA 或 RNA 分子中的細微變化進行定量分析,從而檢測和監測病原體。
與新一代測序 無縫對接
無需使用標準曲線,直接對 NGS 庫執行絕對定量分析。
基因表達分析
可對少量 mRNA 和 miRNA 的細微變化進行準確及重復性極佳的檢測。
環境監測
使用 QX200 系統可測試多種環境樣品,例如土壤和水。
食品檢測
采用經過驗證的 ddPCR 方法對轉基因生物體 (GMO) 進行評估。

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來源:武漢尚碼生物科技有限公司
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